Agnes lahir pada tahun 1268 dari keluarga bangsawan Segni di Gracciano, negara kepausan. Sejak kecil Agnes sudah dekat dengan Tuhan. Ia menghabiskan waktu berjam-jam mendaraskan doa Bapa Kami dan Salam Maria. Saat berusia 6 tahun, ia sudah mendapatkan panggilan menjadi biarawati tetapi karena usianya yang masih kecil ia tidak diizinkan untuk menjadi seorang biarawati. Lalu saat ia berusia 9 tahun ia meyakinkan kembali orang tuanya untuk mengizinkannya bergabung ke Biara Fransiskan untuk perempuan yang dikenal dengan “Sisters of the Sack”. Pada akhirnya, Agnes mendapatkan izin dari Paus untuk bergabung dalam Biara Fransiskan diusia yang sangat muda, walaupun hal ini bertentangan dengan hukum gereja.
Kemudian, Agnes mendapatkan pembinaan dari salah seorang suster yang berpengalaman bernama Suster Margaret. Selama 5 tahun, Agnes benar-benar menikmati kedamaian penuh yang belum pernah dimilikinya.
Pada tahun 1281, Raja Proceno dan tuan tanah Orvieto mengundang para biarawati Montepulciano agar mengirimkan beberapa biarawati ke Proceno untuk mengelola sebuah biara baru dan Agnes adalah salah satu biarawati yang terpilih saat itu. Selain itu, diusia 14 tahun ia juga terpilih menjadi bendahara biara tersebut.
Pada usia ke 20 tahun, Agnes dikenal akan devosinya kepada Sakramen Mahakudus dan kehidupan doa yang mendalam. Ia juga terpilih lagi sebagai kepala biara di usia yang masih muda. Selain itu, Agnes juga dikenal karena karunia mukjizat kesembuhannya untuk orang-orang yang menderita sakit mental maupun sakit fisik. Disisi lain, Agnes juga diberi karunia mukjizat melipat gandakan roti, seperti yang pernah dilakukan oleh Yesus.
Pada tahun 1306, Agnes diutus kembali untuk menjadi kepala biara di Montepulciano. Saat itu, Agnes pun mencapai tingkat doa kontemplatif yang tinggi dan dikaruniai banyak penglihatan. Salah satu karunia penglihatannya yang terkenal adalah saat ia dikunjungi oleh Bunda Maria yang datang sambil menggendong bayi Yesus dipelukannya dan Bunda Maria mengizinkan Agnes untuk menggendong serta membelai-Nya. Agnes menahan dan tidak ingin melepaskan bayi Yesus ketika Bunda Maria ingin mengambil-Nya kembali. Seketika itu juga Agnes tersadar dari ekstasinya dan ia sadar juga bahwa, ia sedang menggenggam erat salib emas kecil yang dikenakan oleh bayi Yesus dileher-Nya. Agnes pun menyimpan salib emas kecil itu sebagai harta yang tak ternilai. Melalui visi yang didapatkannya itu, Agnes mendirikan sebuah gereja yang bernama Gereja Santa Maria Novella di Florence untuk menghormati Bunda Maria.
Pada tahun 1316, kesehatannya semakin menurun dan dokter menyarankan Agnes untuk melakukan terapi pengobatan di pemandian air panas di kota Chianciano Terme. Tetapi pengobatan tersebut tidak membawa dampak baik untuk dirinya. Kesehatannya semakin memburuk dan ia dibawa kembali ke Biara Montepulciano. Ketika Agnes mengetahui bahwa, ia akan meninggal dunia, Agnes mengatakan kepada para biarawati yang sedang berduka bahwa mereka harus bersukacita, karena katanya, “Kalian akan mengetahui bahwa aku tidak meninggalkan kalian. Kamu akan memiliki aku untuk selamanya.”
Agnes meninggal dunia pada tanggal 20 April 1317 di Biara Montepulciano. Ia dikuburkan di Montepulciano dan makamnya segera menjadi tempat ziarah. Agnes dikanonisasi pada tahun 1726 oleh Paus Benediktus XIII. Santa Agnes dari Montepulciano pun digambarkan sebagai biarawati Dominikan dengan salib, bunga lili dan seekor domba.
